1-5-8-2- سینتیک واکنش لیپاز27
1-5-8-3-روش های اندازهگیری فعالیت لیپاز28
1-6- تثبیت آنزیم 30
1-6-1- انتخاب پایه و روش مناسب جهت تثبیت آنزیم31
1-7- کیتین و کیتوسان 32
1-7-1- کیتین33
1-7-2- کیتوسان34
1-7-2-1- کاربردهای کیتوسان35
1-8-تعیین مشخصات نانوذرات کیتوسان 38
فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق
2-1-مروری برمطالعات آنزیمی 41
2-2-مروری بر پیشینه آنزیم لیپاز 42
2-3-تاریخچه تولید کیتین و کیتوسان 44
2-4-تاریخچه تثبیت آنزیم روی نانو ذرات 45
2-5-تحقیقات پیشین در این زمینه 46
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- مقدمه 51
3-2-مواد شیمیایی 52
3-3-وسائل و دستگاه های مورد نیاز 54
3-3-1-ظروف آزمایشگاهی54
3-3-2-دستگاهها54
3-4-روشهای آزمایشگاهی بکار گرفته شده در پایان نامه 58
3-4-1-سنتز نانو ذرات کیتوسان 58
3-4-2-تثبیت آنزیم لیپاز به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شیف59
3-4-3-تعیین خصوصیات نانو ذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی60
3-4-4-تعیین توزیع اندازه ذرات نانوکیتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از زتاسایزر61
3-4-5-طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) 62
3-4-6- اندازهگیری پروتئین تام به روش برادفورد62
3-4-7-اندازهگیری مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان63
3-4-8-اندازهگیری فعالیت آنزیم لیپاز63
3-4-8-1-منحنی استاندارد فعالیت لیپاز64
3-4-8-2-روش اول- اندازهگیری فعالیت لیپاز به روش کیت پارس آزمون (کیت تشخیصی کمی Lipase DC) در سرم یا پلاسما به روش فتومتریک66
3-4-8-3-روش دوم- اندازهگیری فعالیت لیپاز با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP)68
3-4-9- بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان68
3-4-10-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان69
3-4-11-بررسی پارامتر های سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان69
فصل چهارم: نتایج
4-1-مقدمه 71
4-2-تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) 71
4-3-طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) 72
4-4-توزیع اندازه نانوذرات سنتز شده با استفاده از زتا سایزر 74
4-5-فعالیت لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 75
4-6-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 76
4-7-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف 77
4-8-بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 78
4-9-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در دماهای مختلف 79
4-10-پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپازسودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 80
فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری
بحث83
نتیجه گیری 87
مشکلات وپیشنهادات 89
منابع و مآخذ90
فهرست منابع فارسی91
فهرست منابع غیر فارسی92
چکیده انگلیسی100
فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 1-1- نمونههایی ازکاربردهای صنعتی لیپاز 26
جدول 1-2- مزایا و معایب تثبیت آنزیم 31
جدول 1-3- کاربردهای مختلف کیتوسان 37
جدول 3-1- محتویات معرف شماره یک در pH=8 66
جدول 3-2- محتویات معرف شماره دو در pH=466
جدول 3-3- روش کار اندازهگیری فعالیت لیپاز با استفاده از کیت پارس آزمون 67
جدول 4-1- اثر تغییرات pH بر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان در دمای °C4076
جدول 4-2- اثر تغییرات دما برفعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان در pH، 5/7 78
جدول 4-3- مقادیر پارامترهای سینتیکی 80
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1- منحنی استاندارد جهت تعیین فعالیت لیپاز در طول موج 410 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری 64
نمودار4-1- طیف مادون قرمز تبدیل فوریه آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد 73
نمودار4-2- طیف مادون قرمز تبدیل فوریه آنزیم لیپاز سودوموناس تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 73
نمودار4-3- زتا سایزر نانو ذرات کیتوسان قبل از تثبیت آنزیم لیپاز 74
نمودار4-4-زتا سایزر ذرات کیتوسان لیپاز تثبیت شده با گلوتارآلدئید75
نمودار4-5- اثر pHبر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان 76
نمودار4-6- مقایسه فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف 77
نمودار4-7- اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان 78
نمودار4-8- مقایسه درصد فعالیت نسبی لیپاز آزاد و تثبیت شده سودوموناس در دماهای مختلف 79
نمودار4-10- منحنی میکائیلیس- منتن برای آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد 81
نمودار4-11- منحنی میکائیلیس- منتن برای آنزیم لیپاز سودوموناس تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان 81
فهرست شکل ها
عنوانصفحه
شکل 1-1- نمونه ای از مسیر واکنش برای واکنش کاتالیز شده 9
شکل 1-2- ساختار آنزیم 10
شکل 1-3- الگوی القایی مدل کوشلند- حالت دست دردستکش 15
شکل 1-4- اثر غلظت ماده اولیه بر سرعت واکنش آنزیمی17
شکل 1-5- صورت اجمالی اثر غلظت ماده اولیه بر مقدار کمپلکس آنزیم- ماده اولیه تشکیل شده 18
شکل 1-6- منحنی فرضی واکنش آنزیمی 19
شکل 1-7- منحنی اشباع آنزیمی 20
شکل 1-8- نمودار لینویور- برک 22
شکل 1-9- ساختار سه بعدی آنزیم لیپاز 23
شکل 1-10- طرح شماتیکی واکنش لیپولیز 28
شکل 1-11- رایج ترین روشهای تثبیت 32
شکل 1-12- مقایسه ساختار شیمیایی کیتین و سلولز 33
شکل 1-13- ساختار کیتین و کیتوسان 35
شکل 1-14- مقایسه ساختارشیمیایی کیتین و کیتوسان و سلولز 38
شکل 3-1- فرمول شیمیایی گلوتارآلدئید52
شکل 3-2- فرم فضایی گلوتارآلدئید52
شکل 3-3- سانتریفیوژ مورد استفاده در این تحقیق54
شکل 3-4- سنیکیتور مورد استفاده در این تحقیق55
شکل 3-5- اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این تحقیق55
شکل 3-6- استیرر مورد استفاده در این تحقیق56
شکل 3-7- شیکرلوله مورد استفاده در این تحقیق56
شکل 3-8-pH متر مورد استفاده در این تحقیق57
شکل 3-9- ترازوی دیجیتال مورد استفاده در این تحقیق57
شکل 3-10- حمام آبی مورد استفاده در این تحقیق58
شکل 3-11- میکروسکوپ الکترونی روبشی مورد استفاده در این تحقیق60
شکل 3-12- دستگاه زتاسایزر مورد استفاده در این تحقیق61
شکل 4-1- تصویر نانوذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) 72
چکیده:
لیپازها یکی از مهمترین آنزیمها در سیستمهای بیولوژیکی در صنایع مختلف است. کاربرد لیپاز آزاد به دلیل نیمه عمر کمتر در صنایع مقرون به صرفه نیست. تثبیت آنزیم روی پایههای مختلف باعث افزایش پایداری، استفاده مکرر، سهولت جداسازی محصول، کنترل بیشتر واکنش و هزینه کمتر میشود. تثبیت آنزیم غالبا بر روی پایه های متخلخل آلی یا معدنی انجام میشود اما در سالهای اخیر از انواع نانوذرات به دلیل سطح تماس بالا در واحد حجم استفاده شد. هدف از این مطالعه سنتز نانوذرات کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز بطریق کووالان با واسطه گلوتارآلدئید روی نانوذره و مقایسه فعالیت و پارامترهای سینتیکی آنزیم آزاد و تثبیت شده میباشد. ابتدا نانو ذره کیتوسان در آزمایشگاه سنتز و سپس عملیات تثبیت آنزیم بطریق کووالانسی از طریق واکنش بازشیف انجام شد. و با روشهای میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) و زتا سایزر مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. در مرحله بعد فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده به دو روش کیت تشخیصی پارس آزمون و روش استاندارد پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) اندازهگیری و پارامترهای سینتیکی Km و Vm تعیین شدند. نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که اندازه نانوذرات کیتوسان کمتر از nm100 است و بر اساس نتایج زتاسایزر اندازه ذرات قبل از تثبیت در محدوده nm300-10 و بعد از تثبیت آنزیم در محدوده nm500-20 بود. همچنین طیف FT-IR لیپاز آزاد و تثبیت شده بترتیب دارای پیک جذبی در طول موج cm-1 1645 و cm-1 9/1646 میباشند که تثبیت لیپاز روی نانوذرات را تأیید نمود. pH بهینه لیپاز آزاد 7 و تثبیت شده، 5/7 بدست آمد. همچنین لیپاز آزاد در دمای °C30 وتثبیت شده در °C 40 بیشترین فعالیت را نشان داد. اگرچه میزان پایداری و نیمه عمر کمتری در مقایسه با آنزیم تثبیت شده داشت.
براساس نتایج مطالعه حاضر میتوان آنزیم لیپاز را بطور کووالان با واسطه گلوتارآلدئید با موفقیت روی نانوذرات کیتوسان تثبیت نمود و آنزیم تثبیت شده دارای فعالیت و خصوصیات سینتیکی مناسبی برای کاربرد در صنایع مختلف است.
کلمات کلیدی:نانوکیتوسان، لیپازسودوموناس، تثبیت، فعالیت آنزیم، خصوصیات سینتیکی
فصل اول
مقدمات و کلیات
1-1-بیان مسئله:
لیپاز آنزیمی است که چربی را به اسید چرب و الکل هیدرولیز میکند. لیپاز یک آنزیم همه کاره است که کاربرد های صنعتی بسیاری دارد. اما پایداری لیپاز در محیط های مختلف نظیر آنزیمهای دیگر بیش از اندازه پایین میباشد تا امکان استفاده آن را تحت شرایط سخت که برای کاربردهای صنعتی لازم میباشد، میسرکند. به علاوه لیپاز گران قیمت است و به لحاظ اقتصادی استفاده از لیپاز به فرم آزاد مقرون به صرفه نیست و چون نیمه عمر آنزیم آزاد کمتر است و قابلیت بکارگیری مکرر آن محدودیت دارد لذا از آنزیم تثبیت شده بر روی بسترهای مختلف استفاده میکنند. به دلیل قابلیت حل بالای آن در آب نمیتوان از آن مجددا استفاده کرد. بسیاری از تحقیقات استفاده از تکنیک های تثبیت را برای غلبه بر این محدودیت ها مورد بررسی قرار دادند.
برای تثبیت آنزیم لیپاز غالبا از پایه های متخلخل آلی استفاده میشد اما در سال های اخیر از انواع نانو ذرات به دلیل سطح تماس بالا و حجم بالای منافذ که ورود مولکولهای آنزیم را تسهیل میکند استفاده شده است چون فعالیت و قابلیت بکارگیری مکرر و پایداری عملیاتی آن را افزایش میدهد.
یکی از انواع مناسب حامل های نانو، ذرات کیتوسان میباشد که یک نوع پلیمر بیولوژیکی است لذا در این تحقیق خصوصیات سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان بررسی خواهد شد.
1-2-اهداف تحقیق :
این تحقیق در نظر دارد با بکارگیری کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز قابلیت امکان استفاده مکرر ازاین آنزیم را به وجود آورد لذا مهمترین اهداف تحقیق عبارتند از:
1-مشخص کردن میزان فعالیت آنزیم لیپاز تثبیت شده در مقایسه با آنزیم لیپاز آزاد.
2-استفاده از نانو ذره کیتوسان بعنوان بستر مناسب برای تثبیت آنزیم لیپاز بجای تثبیت آن بر روی پایه های متخلخل آلی که بازده کمتری در مقایسه با حامل های نانو دارند.
3-استفاده مکرر و موثرتر آنزیم لیپاز و نیز کاهش هزینه های انجام فرآیند.
1-3- فرضیه های تحقیق:
با توجه به اهداف متصور برای تحقیق حاضر و دستیابی به پاسخ های مناسب برای سوالات مطرح شده فرضیات زیر مورد توجه قرارخواهد گرفت:
1-استفاده از آنزیم لیپاز تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان خصوصیات سینیتیکی مناسب تری نسبت به آنزیم آزاد دارد.
2-نانو کیتوسان بعنوان یکی از بهترین حامل های آلی برای تثبیت آنزیم به شمار می رود.
1-4- مفهوم نانوتکنولوژی1:
نانوتکنولوژی مطالعه ذرات در مقیاس اتمی برای کنترل آنهاست. هدف اصلی اکثر تحقیقات نانوتکنولوژی شکل‌دهی ترکیبات جدید یا ایجاد تغییراتی در مواد موجود است. نانوتکنولوژی در الکترونیک، زیست‌شناسی، ژنتیک، هوانوردی و حتی در مطالعات انرژی بکار برده می شود. نانوتکنولوژی به تولید مواد، قطعات و سیستم های مفید با کنترل آنها در مقیاس طولی نانومتر و بهره برداری از خصوصیات و پدیده های جدید حاصله در آن مقیاس گفته می شود [6]. به عبارت دیگر نانو فناوری به تکنولوژی گفته می شود که کلیه فعالیت ها جهت ایجاد ساختاری ظریف در مقیاس نانو برای تغییر در تک تک اتمها و مولکولها را شامل میشود، به طوری که مواد و وسایل جدید با خواص مورد نظر و مطلوب قابل ساختن میشوند [7]. بدین ترتیب ترکیباتی تولید میشوند که انتظار میرود در بازارهای آینده نقش کلیدی بازی کنند. تفاوت اصلی فناوری نانو با فناوری های دیگر در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوری مورد استفاده قرار میگیرند. البته تنها کوچک بودن اندازه مد نظر نیست، بلکه زمانی که اندازه مواد در این مقیاس قرارمیگیرد، خصوصیات ذاتی آنها از جمله رنگ، استحکام و … نیز تغییر مییابد[8].
1-4-1-کاربردهای نانو تکنولوژی:
امروزه فناوری نانو به طور شگفت آوری در تمامی علوم وارد شده و نقش تعیین کننده ای در مراحل مختلف تولید ایفا میکند که در زیربه طور مختصر به برخی کاربردهای آن اشاره میشود:
1-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی: نانو تکنولوژی تغییر بنیانی مسیری است که در آینده، موجب ساخت مواد و ابزارها خواهد شد. امکان سنتز بلوک های ساختمانی نانو با اندازه و ترکیب به دقت کنترل شده و سپس چیدن آنها در ساختار بزرگتر، که دارای خواص منحصر به فرد باشند، انقلابی در مواد و فرآیندهای تولید آنها، ایجاد میکند. از مزایای نانوساختارها میتوان به سبکتر، قویتر و قابل برنامهریزی بودن آنها، کاهش هزینه عمر کاری آنها از طریق کاهش دفعات نقص فنی، ابزارهایی نوین بر پایه اصول و معماری جدید اشاره کرد ]9[.
1-4-1-2- پزشکی و بدن انسان: رفتار مولکولی در مقیاس نانومتر، سیستم های زنده را اداره میکند. یعنی مقیاسی که شیمی، فیزیک، زیستشناسی و شبیه سازی کامپیوتری، همگی به آن سمت در حال گرایش هستند ]10[.
فراتر از سهولت استفاده بهینه از دارو، نانوتکنولوژی میتواند فرمولاسیون و مسیرهایی برای رهایش دارو، تهیه کند، که توان درمانی داروها را افزایش دهد ]11[.
1-4-1-3- پایداری منابع: میتوان به منابعی همچون کشاورزی، آب، انرژی، مواد و محیط زیست پاک اشاره کرد. گستردگی تعاملات بین این فناوری و علوم جانبی آنها، از ویژگیهای کاملا بارز این فناوری جدید است. تقسیمبندی فناوری نانو در شاخهها و رشتههای مختلف بیشتر مربوط به کاربرد محصولات این فناوری در هر رشته میباشد. در ضمینه مسائل زیست محیطی، غذایی، دارویی نیز استفاده از نانو اجتناب ناپذیر خواهد بود.
1-4-1-4- صنایع غذایی: حوزههای مختلف کاربردی فناوری نانو در غذا و صنایع غذایی را می توان به پنج دسته زیر تقسیم بندی نمود:
الف- بهبود طعم و رنگ: به کمک فناوری نانو توانسته اند در مواد غذایی مختلف خواصی ایجاد کنند که ایجاد احساس طعم و بوی خاص در مصرف کننده میکند. مثلا تولید سس کم چربی که مزه چربی میدهد در حالی که چربی ندارد.
ب- سلامت غذایی: برای اطمینان از سلامت غذایی، پژوهشگران در پروژهای از نانو حسگرهای قابل حمل برای یافتن مواد شیمیایی مضر، پاتوژنها وسمها در مواد غذایی استفاده کردهاند، با این کار نیازی به فرستادن نمونههای مواد غذایی به آزمایشگاه، برای تشخیص سلامت و کیفیت محصولها در کشتزارها و کشتارگاهها نیست. همچنین این پروژه، در حال توسعه بهکارگیری زیست تراشههای DNA برای کشف پاتوژن هاست. این روش میتواند در تشخیص باکتری های مضر و متفاوت در گوشت یا ماهی ویا قارچ های میوه مؤثر باشد.
ج-بستهبندی: بستهبندی در واقع اولین ارتباط مشتری با محصول است.بیشترین کاربردی که نانو در صنعت دارد مربوط به بستهبندی است چراکه:

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1: بستهبندی، محصول را از صدمات فیزیکی و آلودگیها حفظ میکند.
2:کیفیت ضدمیکروبی و خواص ممانعتی آن، بهداشت بهتر، کنترل بیشتر، ممانعت از بیرنگی و خسارت کمتر به ساختار آن را باعث میشود.
3: استحکام در برابر حرارت. یعنی از فساد و پلاسیدگی میوهها و سبزیها در دمای بالا جلوگیری میکند.
4: زمان ماندگاری محصولات در بستهبندیهای نانو از سه یا چهار روز به دو تا سه هفته در شرایط دمای محیط بیرون از یخچال افزایش مییابد.
د- تولید غذا: در بخش تولید میتوان در صنعت کشاورزی و همچنین در ابداع روشهای جدید برای تولید غذا از این فناوری بهره گرفت مانند: آنتی بیوتیکها، ژنهای گوناگون گیاهان، تولید آفتکشهای بی خطر و کاهش اثرات منفی آفتکشهای موجود.
و- نگهداری غذا:
1- ضدعفونی و ضد میکروب نمودن سطوح: نانو میتواند با جابهجا کردن سطح پوشش مواد، از ورود هرگونه ریزساختههای زنده یا میکروب به غذا جلوگیری کرده و سبب ضدعفونی شدن سطوح غذاها شود.
2- حفاظت آنتی اکسیدانها: با استفاده از نانو حفرهها میتوان از خراب شدن مواد بیثباتی مثل آنتی اکسیدانهای حساس از جمله ویتامینهای E ،D،A و امگا3 جلوگیری به عمل آورد.
3- دستکاری و کنترل فعالیت آنزیمها: نانو حفرهها میتواند در شناسایی و طراحی ساختمان آنزیمها و کنترل سوخت و ساز آنها با تغییر در ساختار و افزودن ذرات فعال به مواد غذایی استفاده شود.
1-5- آنزیم ها:
زندگی به یک سری واکنشهای شیمیایی وابسته است که بسیاری از این واکنشها بسیار کند انجام گرفته و به خودی خود قادر به حفظ حیات نمیباشند. این واکنشها با کاتالیستهایی به نام آنزیم تسریع میشوند. توان کاتالیزوری آنزیمها، انجام فرآیند لازم برای حیات در تمام موجودات از میکرواورگانیسمها تا انسانها تسهیل میکنند. بسیاری از آنزیمها پتانسیل کاتالیزوری خود را پس از استخراج از ارگانیسم زنده حفظ میکنند و قابل استفاده در فرآیندهای صنعتی میباشند]12[.
1-5-1- خصوصیات آنزیمها:
آنزیمها دارای ساختار پروتئینی میباشند و به عنوان کاتالیزورهای بیولوژیکی برای انجام واکنشهای شیمیایی در مقایسه با کاتالیزورهای غیر بیوشیمیایی مزایائی مثل: ویژه بودن محصول وسوبسترا فعالیت تحت شرایط ملایم واکنش، خارج کردن آسان محصول، ‌کاهش استفاده از مواد شیمیایی سمی، تولید سریع کاتالیزور از منابع قابل تجدید، انرژی اکتیواسیون مطلوب و بازدهی کاتالیزوری مناسب دارند.
آنزیمها ترکیباتی هستند که میتوانند سرعت واکنش را تا حدود 107 برابر افزایش دهند. آنزیم مانند یک کاتالیزگر غیرآلی واکنش را با پایین آوردن انرژی فعال سازی2 لازم برای انجام واکنش تسریع میکند و بر خلاف آن انرژی فعال سازی را با جایگزین کردن یک سطح انرژی فعال سازی کوچک پایین میآورد]13[ شکل 1-1.
انجام سریع یک واکنش در موقعیت آزمایشگاهی به شرایط ویژهای مانند دما و فشار بالا نیاز دارد. لذا باید در یاخته که شرایط محیطی در آن کاملا ثابت است و انجام چنین واکنشهایی بسیار کند است، این عمل بوسیله آنزیمها صورت گیرد.
کاتالیزورها در واکنشها بدون تغییر میمانند، ولی آنزیمها مانند سایر پروتئینها تحت شرایط مختلف پایدار نمیمانند. این مواد در اثر حرارت بالا و اسیدها و قلیاها تغییر میکنند تا به تعادل برسند. آنزیمها با کاهش انرژی فعالسازی سرعت واکنش شیمیایی را افزایش میدهند ]15 و14[.
شکل 1-1- نمونه ای از مسیر واکنش برای واکنش کاتالیز شده
آنزیمها مولکولهای پروتئینی هستند که دارای یک یا چند محل نفوذ سطحی ( جایگاههای فعال) هستند که سوبسترا یعنی مادهای که آنزیم بر آن اثر میکند، به این نواحی متصل میشود. تحت تأثیر آنزیمها، سوبسترا تغییر میکند و به یک یا تعدادی محصول تبدیل میشود. از دیدگاه صنعتی، تولید، تغلیظ، استخراج و خالص سازی آنزیمها از محیطهای کشت حاوی Aspergillus،Penecillium ،Mucor، وRhizopus امکانپذیر بوده و تولید آنها دارای توجیه اقتصادی است ]16 [. آنزیمها ماهیتی پروتئینی دارند و ساختار بعضی ساده یعنی از یک زنجیره پلیپپتیدی ساخته شدهاند و بعضی الیگومر هستند. ساختار بعضی از آنزیمها منحصرا از واحد های اسید آمینه تشکیل یافته اما برخی دیگر برای فعالیت خود نیاز به ترکیبات غیرپروتئینی دارند که به نام گروه پروستتیک3 معروف است و این گروه میتواند یک فلز یا یک کوآنزیم4 باشد و با آنزیم اتصال محکمی را برقرار میکنند. بخش پروتئینی آنزیم (بدون گروه پروستتیک) آپوآنزیم5 نام دارد و مجموع آنزیم فعال از نظر کاتالیزوری و کوفاکتور مربوطه هولوآنزیم6 نام دارد.
از ویژگیهای مهم آنزیمها این است که پس از انجام هر واکنش و در پایان آن سالم و دست نخورده باقی میمانند و میتوانند واکنش بعدی را کاتالیز کنند. در یک واکنش ساده آنزیمی، ابتدا آنزیم (E) با ماده اولیه یا سوبسترا7 (S) ترکیب میشود و کمپلکس آنزیم-سوبسترا میدهد در مرحله بعدی با انجام واکنش، فراورده یا محصول (P) ایجاد میشود و آنزیم رها میگردد ]17-19[.
شکل 1-2- ساختار آنزیم
در زیر نمونه ای از واکنشهای ساده آنزیمی نشان داده شده است:
E + S ? ES
ES ? E + P
1-1-واکنش آنزیمی
1-5-2- خصوصیات واکنشهای آنزیمی:
آنزیمها کاتالیزورهای زیست شناختی ای هستند که طبیعتا از مولکوهای پروتئین، توسط سلولهای زنده (حیوانی، گیاهی و میکروارگانیسمها) تولید میشوند. آنزیمها در واکنشهای زیست شناختی نقش بسیار عمده ای بر عهده دارند و در اغلب واکنشهای درون سلولی باعث شکستن پیوندهای شیمیایی ترکیبات میشوند، بنابراین، ویژگی عمده این مواد، افزایش سرعت واکنشهاست بدون اینکه خود در واکنش شرکت داشته باشند.

قابلیت کاتالیزگری آنزیم ها به خاطر وجود مولکولهای پروتئین با ساختمانهای ویژه در آنهاست و واکنشهای شیمیایی در موضع مخصوصی بهنام موضع فعال آنزیم انجام میپذیرند. و اصولا پاره ای از برهم کنشهای فیزیکی و شیمیایی در این موضع باعث انجام این واکنشها برای یک آنزیم ویژه میشود.
تفاوت عمده واکنشهای آنزیمی با واکنش های شیمیایی در موارد زیر خلاصه میشود:
1-یک آنزیم کاتالیزگر دارای ویژگی خاصی است که فقط قادر است یک یا تعداد کمی از واکنشها را کاتالیز کند.
2-سرعت انجام واکنشهای شیمیایی با حضور آنزیم به مراتب بالاتر از حالت بدون آنزیم است و معمولا با بکارگیری مقادیر بسیار کمی آنزیم، واکنشها کاتالیز میشوند.
3-شرایط فیزیکی نظیر دما، فشار و pHمحیط در واکنشهای آنزیمی معمولا در حد متعادل بوده و از فشار و دماهای بالا کمتر استفاده میشود.
4-آنزیمها در مقابل تغیرات ناگهانی شرایط، حساس و ناپایدارند و کار کردن با آنها مستلزم دقت و توجه خاص است ]1 [.
با توجه به اینکه ساختمان شیمیایی آنزیمها از پروتئین با آمینو اسیدهای ویژه ای شکل گرفته است تولید انبوه آنها از طریق سنتز شیمیایی بسیار مشکل و در بعضی حالات غیر عملی است. آنزیمها معمولا از لحاظ میکرواورگانیسمهای رشد یافته در محیطهای خالص و مخصوص، یا به طور کلی آنزیمهای تجارتی، به سه گروه اصلی طبقه بندی میشوند:
1-آنزیمهای صنعتی که در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی به کار گرفته میشوند، مانند: آمیلاز، پروتئاز، کاتالاز و پنیسیلین آسیلاز.
2-آنزیمهای تجزیه ای که در تجزیه مواد از آنها استفاده میشود. نظیر گلوکز اکسیداز، گالاکتوز اکسیداز، الکل دهیدروژناز ، هگزوکیناز، مورامیداز، کلسترول اکسیداز.
3-آنزیمهای پزشکی که در مسائل پزشکی مورد توجه اند مثل آسپاراژیناز، پروتئاز، لیپاز، و استرپتوکیناز.
کاربرد آنزیمها در صنایع، روز به روز گسترش مییابد و دلیل عمده ی آن، تولید محصولی است با درجه ی خلوص و کیفیت بالاتر، به طور کلی مزایای کاتالیزگر آنزیمی به مراتب بیشتر از کاتالیزگرهای غیرآنزیمی است زیرا با استفاده از کاتالیزگر اختصاصی آنزیمی میتوان از واکنشهای ناخواستهی جانبی که در طی مصرف کاتالیزگرهای غیر اختصاصی انجام میشوند اجتناب کرد ]2[.
قدرت آنزیمها در بهکارگیری اثرشان در دماهای نسبتا پایین کمک بیشتری به پیشگیری از واکنشهای جانبی ناخواسته میکند. بهدلیل آنکه آنزیمها را معمولا با غلظتهای خیلی کم مصرف میکنند، جداسازی آنها پس از تکمیل واکنش معمولا غیرضروری و یا آسانتر از حالتی است که کاتالیزگر استفاده شود و پیشرفتهای اخیر در زمینه تهیه و استفاده از آنزیمهای تثبیت شده که با مواد نامحلول واسطهی واکنش ایجاد پیوند میکنند ویا جذب آنها میشوند، باعث افزایش امتیازات سیستمهای کاتالیزگر آنزیمی شده است. این آنزیمها حتی در مواردی که آنزیم واقعا به صورت محلول نیست مؤثر عمل میکند در نتیجه مشکل جداسازی آنزیم از ماد? اولیه در انتهای واکنش به حداقل میرسد، زیرا فاز جامد و آنزیم ملحق شده به آن را میتوان به راحتی به روش صاف کردن جدا کرد. سپس آنزیم برای انجام واکنش های بعدی قابل استفاده است. در بسیاری از موارد، استفاده از آنزیم تثبیت شده در یک سیستم پیوسته امکان پذیر است. به عنوان مثال، محلولی از مواد واکنش آنزیمی به طور پیوسته از بستری از آنزیم عبور کرده واکنش مورد نظر به هنگام عبور جریان مایع انجام میشود. میزان انجام واکنش را میتوان با تنظیم سرعت عبور محلول از بستر ثابت آنزیم کنترل کرد.
معمولا استفاده از آنزیم با غلظت زیاد برروی مواد جامد، که بتواند مدت زمان لازم برای انجام واکنش در محلول را طی عبور از واکنشگاههای بسیار کوتاه کند، امکانپذیر است. بنابراین میتوان میزان انجام واکنش در زیست واکنشگاههای کوچک را نیز افزایش داد. به این ترتیب، مدت قرار گرفتن ماد? اولیه تحت شرایط دما و pH لازم برای انجام واکنش، کم میشود، در نتیجه واکنشهای جانبی که احتمالا طی واکنش دراز مدت اتفاق میافتد به میزان زیادی کاهش مییابد و درج? خلوص محصولات واکنش زیادتر خواهد شد. امکان استفاده از آنزیم با غلظت زیاد در حالت تثبیت شده، باعث انجام واکنش به طور پیوسته و در دمای نسبتا کم و همچنین استفاده از زیست واکنشگاههایی با ابعاد مناسب میشود. به این ترتیب، مدت فعالیت آنزیم بیشتر شده در نتیجه هزینهی کلی به ازای وزن واحد محصول کاهش مییابد ]1 [.
به طور کلی ویژگیهای کاتالیزگری یک آنزیم را ساختمان شیمیایی و ترکیب آن تعیین میکند. میزان انجام واکنش نوری و درج? نهایی آن بستگی به عوامل متعددی از قبیل غلظت ماد? اولیه و آنزیم، دما، pH، قدرت یونی، فعالسازها، بازدارندههای خاص و مدت انجام واکنش دارد. عوامل مشابهی نیز برمیزان انجام واکنش بدون فعالیت کاتالیزی اثر میگذارند. گرچه اثر کاتالیزگرهای آنزیمی به طور کلی اختصاصی است، اما یک آنزیم میتواند واکنشهایی را که شامل ترکیبات کاملا مختلف هستند کاتالیز کند. در چنین مواردی پیوندهای بین اتمی و گروههای همسایه مشابه هستند. در کاربردهای صنعتی آنزیم، میتوان از کلی? عاملهای موثربر خواص کاتالیزی آنزیم برای کنترل استفاده کرد. در بیشتر موارد شرایطی مورد استفاده قرار میگیرد که تحت تاثیر آنها اقتصادی ترین موازنه بین عامل های موثر بر میزان واکنش اصلی مورد نظر و واکنشهای جانبی ناخواسته و میزان کاهش فعالیت آنزیمی ایجاد گردد. بنابراین شرایط بهینه در استفاده صنعتی از یک آنزیم، ممکن است با شرایط موصوف نظری درباره آنزیم بسیار متفاوت باشد. طبیعتا هزینه مناسب و افزایش ارزش محصول تولیدی در تعیین شرایط بهین? صنعتی، در درجه اول اهمیت قرار دارند ]2[.
1-5-3- پارامترهای موثر بر واکنش های آنزیمی:
پارامترهای محیطی متعددی بر توان کاتالیزوری آنزیم تأثیر میگذارند. این فاکتورها نه تنها بر فعالیت آنزیم، بلکه بر پایداری آن نیز اثر میگذارند. در این بخش به برخی از این پارامترها اشاره میشود.
1-5-3-1- دما :
از مهمترین پارامترهای موثر درسیستم های بیولوژیکی میباشد. در فرآیندهای آنزیمی، دما، اثرات معکوس بر فعالیت و پایداری آنزیم اعمال میکند. افزایش دما سرعت واکنش شیمیایی را افزایش می دهد و در عین حال باعث میشود آنزیم با سرعت بیشتری فعالیت خود را از دست دهد. معمولا در دماهای پایین تر از 30 درجه سانتیگراد و برای دوره زمانی کم، از دست رفتن فعالیت آنزیم ناچیز بوده و با افزایش دما سرعت واکنش افزایش مییابد. در دماهای بالاتر، فعالیت آنزیم با پیشرفت واکنش، سرعت بیشتری کاهش مییابد. بنابر این مقدار بهینه دما با افزایش زمان واکنش کاهش مییابد]20[.
1-5-3-2-pH:
عملکرد آنزیم به شدت تحت تاثیر pHقرار میگیرد. کاهش فعالیت آنزیم در محدوده ای از pH میتواند در نتیجه دو عامل اصلی باشد. اول، pHبر پایداری آنزیم اثر میگذارد و میتواند آن را به طور برگشت ناپذیری غیرفعال کند. دوم تغییر pH میتواند پارامترهای سینتیکی واکنش آنزیمی را تغییر دهد. به این صورت که ممکن است بر پایداری حالت واسطه و یا بر مرحله کنترل کننده سرعت واکنش تأثیر بگذارد ]21[.
1-5-3-3-بازدارندهها8:
بسیاری از ترکیبات طبیعی و شیمیایی در واکنش های آنزیمی نقش بازدارنده دارند. بازدارندهها ترکیباتی شیمیایی هستند که با اضافه شدن به مخلوط واکنش سرعت واکنش های آنزیمی را کاهش میدهند. بازدارنده ها به دو دسته کلی بازدارنده های برگشت پذیر و برگشت ناپذیر تقسیم میشوند. بازدارنده های برگشت ناپذیر، با برقراری پیوندهای غیرکووالانسی 9با آنزیم، کاملا آن را غیر فعال میکنند. آنزیم غیر فعال شده با این نوع بازدارنده ها را نمیتوان با دیالیز10 یا روش های ساده فعال کرد. بازدارنده های برگشت پذیر پیوندهای کووالانسی با آنزیم برقرار کرده و فعالیت آنزیم را کاهش میدهند. این نوع بازدارنده ها با دیالیز حذف شده و مجددا فعالیت کاتالیزوری آنزیم به طور کامل قابل دستیابی است ]22[.
هر آنزیم بر سوبسترای ویژه خود اثر کرده و فرآورده ویژهای را تولید میکند. به این منظور هر آنزیم ساختار سه بعدی ویژه خود را دارا است. که آن را برای انجام فعالیت کاتالیستی مناسب میسازد و بخشی از آنزیم که با سوبسترا بند و بست مییابد، جایگاه فعال نام دارد ودر مورد اتصال آنزیم به سوبسترا الگوهایی ارائه شدهاند که مدل کوشلند11 که الگوی القایی نام دارد و حالت دست در دستکش را دارد، نشان میدهد. بطوری که محل اتصال حالت انعطافپذیری دارد ]23-25 [.
شکل 1-3- الگوی القایی مدل کوشلند- حالت دست دردستکش
1-5-4- سینتیک واکنش آنزیمی:
اصول کلی سینتیک واکنشهای آنزیمی مشابه سینتیک واکنشهای شیمیایی است با این تفاوت که در آنزیمها پدیده سیرشدگی آنزیم توسط ماده اولیه مشاهده میشود، در حالی که این پدیده در واکنشهای غیرآنزیمی دیده نشده است. پدیده سیرشدگی آنزیم توسط ماده اولیه در تمام آنزیمها صادق است. یعنی جهت دستیابی به سرعت بیشینه واکنش، باید آنزیم به حالت سیر شده از ماده اولیه موجود باشد. سرعت واکنش آنزیمی تحت تأثیر بسیاری عوامل فیزیکی و شیمیایی واقع می شود که به ترتیب مدنظر قرار میگیرند.
برای اولین بار مدل ریاضی سینتیک واکنش آنزیمی در سال 1902 میلادی توسط هنری12 ارائه شد و در سال 1913 میکائلیس13 و منتن14 یک نظریه کلی راجع به سینتیک آنزیمی بیان کردند، اکثر واکنشهای آنزیمی ساده با سینتیک میکائیلس- منتن یا سینتیک اشباع بررسی میشوند. یک محلول آنزیمی تعداد ثابتی موضع فعال جهت پیوند با سوبسترا دارد. در غلظتهای بالا از سوبسترا، تمام این مواضع فعال توسط سوبسترا اشغال شده و در واقع آنزیم اشباع میگردد. سینتیک اشباع از یک طرح ساده واکنش به دست میآید که شامل یک مرحله برگشت پذیر جهت تشکیل حالت واسطه و یک مرحله برگشت ناپذیر جهت تجزیه حالت واسطه میباشد]26 [.
1-2- واکنش ساده آنزیمی مدل میکائیلیس- منتن
1-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعالیت آنزیمها:
سرعت واکنش آنزیمی تحت تأثیر عواملی مانند غلظت ماده اولیه، غلظت آنزیم، pH، دما، وجود فعالساز و مهارکننده، ثابت دی الکتریک و قدرت یونی حلال واقع می شود. جهت تعیین اثر هر یک از عوامل ذکر شده بر روی خصوصیت آنزیم لازم است بقیه عوامل ثابت نگهداشته شوند.
1-5-5-1-اثر غلظت ماده اولیه برسرعت واکنش آنزیمی:
جهت بررسی اثر غلظت ماده اولیه برسرعت واکنش آنزیمی، لازم است کلیه پارامترها از جمله غلظت آنزیم را ثابت نگهداشته و تنها غلظت ماده اولیه تغییر کند.
سرعت واکنش آنزیمی برحسب غلظت ماده اولیه طبق شکل زیرتغییر میکند.
شکل 1-4- اثر غلظت ماده اولیه بر سرعت واکنش آنزیمی
طبق فرضیات هانری و براون در سال 1902، اگر غلظت ماده اولیه پایین باشد، تمام مولکولهای آنزیم با ماده اولیه ترکیب نمیشود. در حالت غلظت بالای ماده اولیه، مقدار بیشتری از آنزیم با ماده اولیه ترکیب میشود و بالاخره در غلظت بالاتر تمام آنزیم با ماده اولیه ترکیب میشود .
شکل 1-5- صورت اجمالی اثر غلظت ماده اولیه بر مقدار کمپلکس آنزیم- ماده اولیه تشکیل شده
در صورتی که تمام آنزیم با ماده اولیه ترکیب شود و آنزیم توسط ماده اولیه به حالت سیرشده درآید، افزایش بیشتر غلظت ماده اولیه، منجر به افزایش سرعت واکنش نمی شود و سرعت واکنش در این حالت سرعت پیشینه نامیده می شود.
1-5-6- معادله میکائیلیس- منتن:
اولین مدل ریاضی در مورد سرعت واکنش آنزیمی توسط میکائیلیس و منتن در 1913 براساس نظریه هانری و براون ارائه شد . طبق نظریه میکائیلیس و منتن در روابط زیر، E، آنزیم یا S، ماده اولیه و ES مجموعه آنزیم ـ ماده اولیه هستند. در شکل زیر منحنی فرضی واکنش آنزیمی دیده می شود.
شکل 1-6- منحنی فرضی واکنش آنزیمی ـ در حالت (الف) و (ب) واکنش برگشت ناپذیر است.
در حالت (الف)، غلظت آنزیم و ماده اولیه با هم برابرند. در حالت (ب)، غلظت ماده اولیه بیشتر از غلظت آنزیم است.
همانطور که در واکنش 1-2 مشخص است، سرعت تولید محصول به صورت زیر است:
1-3
سرعت کلی تولید حالت واسطه تفاضل سرعت واکنشهای تولید و مصرف این ماده میباشد:
1-4
ثابت میماند :
1-5
غلظت کل آنزیم برابر مجموع غلظتهای آنزیم آزاد و آنزیم متصل به سوبسترا میباشد:
1-6
با ترکیب روابط (1-4) و (1-6) عبارت زیر به دست میآید:
1-7
ثابت میکائیلیس (KM) ، به صورت زیر تعریف میشود:
1-8
در منحنی اشباع آنزیمی، Vm از نقاط سرعت های بهدست آمده در غلظت های بالای سوبسترا حاصل میشود. این نقاط در امتداد یک خط افقی قرار گرفته اند که محور V را در محل V=Vm قطع میکند.حال اگر نصف مقدار فوق یا 1/2Vm روی محور مشخص شده و از آن خطی به موازات محور V رسم گردد، محل تقاطع خط با منحنی معرف مقدار سوبسترایی است که مقدار عددی آن مساوی Km میباشد. به عبارتی میتوان گفت Km معادل مقدار سوبسترایی است که نصف سرعت ماکزیمم را ایجاد نماید. این ارتباط از طریق معادله میکائیلیس- منتن نیز حاصل میشود. زیرا چنانچه به جای S در معادله، Km جایگزین شود مقدار V=1/2Vm به دست میآید.
شکل 1-7- منحنی اشباع آنزیمی


پاسخ دهید